תקציר:
מנגנונים אפשריים של מוות תאי בתאים המודבקים בחיידק Simkania negevensis הקדמה: Simkania negevensis היא חיידק אובליגטורי תוך תאי של תאי אאו-קריוטים, השייכת למשפחת ה-Simkaniaceae בסדרה Chlamydiales. משפחות נוספות בסדרה זו הן משפחות Chlamydiaceae, Waddliaceae ו-Parachlamydiaceae.  S. negevensisנפוצה בכל רחבי העולם, ונמצאה קשורה למחלות נשימה שונות, כמו דלקת-ריאות ודלקת הסימפונות.
אחד ההבדלים המהותיים בין S. negevensis לשאר חיידקי הסדרה Chlamydiales, הוא השוני במחזור החיים שלהם. הדבקה בחיידקי כלמידיה מאופיינת על ידי מחזור חיים בן שלושה ימים שבתחילתו יש עיכוב של אפופטוזיס, הידוע כמוות מתוכנן של התאים (Programmed cell death – PCD), ובסופו יש שפעול של מנגנוני מוות תאי הגורמים לליזיס של התא המאכסן, ומאפשרים לחיידק להתחיל מעגל הדבקה חדש. לעומת זאת,S. negevensis  מתרבה בתוך התא המאכסן במשך 2-4 ימים, ונשארת בתוך התאים עד 15 יום לאחר ההדבקה בלי לגרום לליזיס של התא.
לא ידוע כיצד מצליח החיידק להישאר בתוך התאים, אך סבורים כי מעורב בכך מנגנון של עיכוב מוות תאי בכלל, ו-PCD בפרט. מטרת המחקר: לקבוע האם S.
negevensis מעכבת או משפעלת מוות תאי, מהו המנגנון האפשרי דרכו היא פועלת ובאיזה שלב של ההדבקה מתרחש התהליך.
שיטות: תאי Vero הודבקו ב- S. negevensisבתנאים שונים, כולל מתן אינדוקציה חיצונית לאפופטוזיס באמצעות מעכב הקינאזות Staurosporine בחלק מהמקרים, והתוצאות שהתקבלו בתאים המודבקים הושוו אל מול התוצאות בתאי הביקורת שלא הודבקו. נבדקו מרקרים שונים המקובלים בספרות למוות תאי, כמו טרנסלוקציה של החלבון פוספאטידיל-סרין (PS) מחלקה הפנימי של ממברנת התא אל חלקה החיצוני, פרגמנטציה של גרעיני התאים, טרנסלוקציה של החלבון המיטוכונדריאליCytochrome c   (Cyt c), המעורב באינדוקציה של קסקדת האפופטוזיס תלוי-הקספאזות, אל ציטופלסמת התא ובדיקת פעילות האנזים Caspase-3, שהוא חלבון מפתח במנגנון האפופטוזיס תלוי-הקספאזות.
תוצאות ומסקנות: תוצאות המחקר מצביעות על כך ש-S. negevensis משפעלת תהליך של מוות תאי, ככל הנראה במנגנון שאינו תלוי-קספאזות, עם עיכוב אפשרי של תהליך הנקרוזיס, שהוא תהליך המוות הלא מתוכנן של התא (Non-programmed cell death – NPCD) המתרחש בדרך כלל במצבים פתולוגיים. נכון לעכשיו, על בסיס המובא בספרות בכל הנוגע לחיידקי כלמידיה ומוות תאי, אנו מציעים את המינוח "Simkania-induced cell death" כמינוח מקובל למנגנוני הפעולה של S. negevensis.
דרוש מחקר נוסף על מנת להוכיח כי S. negevensis אכן גורמת לשפעול PCD ולעיכוב נקרוזיס, אך אולי חשוב מכך – על מנת לברר כיצד זה ש- S. negevensis משפעלת מנגנוני מוות תאי מחד, אך נשארת בתוך התאים זמן כה רב מאידך.
תוכן העניינים
נושא עמוד רשימת טבלאות ואיורים רשימת קיצורים
1 . מבוא
1
     1.1     סדרת ה-Chlamydiales
1                1.1.1     מיון
1                1.1.2     מבנה
2                1.1.3     מעגל ההדבקה
3      1.2     משפחת ה-Chlamydiaceae
4                1.2.1     מיון
4                1.2.2     מעגל ההדבקה
4                1.2.3     מופעים קליניים ותפוצה 5
     1.3     משפחת ה-Simkaniaceae
6                1.3.1     מיון
6                1.3.2     מבנה
6                1.3.3     מעגל ההדבקה
6                1.3.4     מופעים קליניים ותפוצה 7
     1.4     מוות תאי
8                1.4.1     מבוא
8
               1.4.2     אפופטוזיס – Programmed cell death (PCD) 9
               1.4.3     נקרוזיס – Non-Programmed cell death (NPCD)
1 3
               1.4.4     אפונקרוזיס
1 5
     1.5     Chlamydiaceae ומוות תאי
1 6
               1.5.1     מבוא
16
               1.5.2     Chlamydiaceae ואפופטוזיס   
1 6
               1.5.3     Chlamydiaceae ונקרוזיס
2 0                1.5.4     ההשערה כיום
2 1
2 . מטרת המחקר
2 4
3 . חומרים
2 5
     3.1     חומרים כלליים ומקורם
2 5
     3.2     מכשור
2 7
     3.3     בופרים ותמיסות
2 7
     3.4     מצעי גידול
2 8
     3.5     ציוד מיוחד
2 9
     3.6     ערכות בדיקה
2 9
4 . שיטות עבודה
3 0      4.1     שיטות עבודה בסיסיות
3 0                4.1.1     גידול תאים
3 0                4.1.2     הדבקת תאים
3 0                4.1.3     ספירת תאים
3 0                4.1.4     הכנת סטוק חיידקי Simkania negevensis
3 0                4.1.5     טיטרציה
3 0      4.2     שיטות עבודה ייחודיות
3 1
               4.2.1     זיהוי מוות תאי באמצעות צביעה פלואורוסצנטית עם Annexin-V                             ו-Propidium Iodide.
3 1
4 .2.2        זיהוי מוות תאי באמצעות בדיקת דגרדציה של גרעיני התאים באמצעות Hoechst.

3 2
4 .2.3        זיהוי מוות תאי על ידי בדיקת טרנסלוקציה של Cytochrome c אל ציטופלסמת התא בשיטת ELISA.

3 3
4 .2.4        זיהוי מוות תאי ידי בדיקת טרנסלוקציה של Cytochrome c אל ציטופלסמת התא בשיטת Western Blot Analysis.

3 6
4 .2.5        זיהוי מוות תאי באמצעות צביעה פלואורוסצנטית של האנזים קספאז-3.

3 7
5. תוצאות
3 8
     5.1     זיהוי מוות תאי באמצעות צביעה פלואורוסצנטית עם Annexin-V                ו-Propidium Iodide.
3 8
     5.2     זיהוי מוות תאי באמצעות בדיקת דגרדציה של גרעיני התאים באמצעות                  Hoechst.
40      5.3     זיהוי מוות תאי על ידי בדיקת טרנסלוקציה של Cytochrome c אל ציטופלסמת                התא בשיטת ELISA.
42
     5.4     זיהוי מוות תאי ידי בדיקת טרנסלוקציה של Cytochrome c אל ציטופלסמת                 התא בשיטת Western Blot Analysis.

4 6
     5.5     זיהוי מוות תאי באמצעות צביעה פלואורוסצנטית של האנזים קספאז-3.

4 9
6 . דיון ומסקנות 51
     6.1     דיון 51
     6.2     מסקנות 53
7.
ביבליוגרפיה 55
טבלאות ואיורים רשימת איורים איור עמוד איור 1: הקלספיקציה הישנה למול הקלסיפיקציה החדשה בסדרה Chlamydiales.
1
איור 2: מעגל ההדבקה של חיידקי סדרת ה-Chlamydiales.
3
איור 3:
סיכום תהליכי האפופטוזיס במנגנון תלוי הקספאזות, ובמנגנון שאינו            תלוי-קספאזות.

1 2
איור 4: סיכום תהליכי המוות התאי השונים המוכרים.
15
רשימת תמונות תמונה עמוד תמונה 1: דוגמאות צביעה פלואורוסצנטית ב-Hoechst של גרעיני תאי Vero המודבקים              ב-S.
negevensis ותאי ביקורת, עם וללא טיפול ב-Staurosporine.

4 1
תמונה 2: תוצאות אנליזת  Western Blot שבוצעה עם נוגדן לחלבון Cytochrome c, בתאי              Vero ובתאי Hela המודבקים ב-S. negevensis ובתאי ביקורת, עם וללא              טיפול ב-Staurosporine.

4 8
תמונה 3: תוצאות פעילות קספאז-3 שלושה ימים ושבעה ימים בתאי Vero המודבקים                     ב-S. negevensis ובתאי ביקורת, עם וללא טיפול ב-Staurosporine.
50 רשימת טבלאות טבלה עמוד טבלה 1: דוגמה לחישוב כמות החלבון Cytochrome c בפרקציות הציטופלסמה             והמיטוכונדריה, על פי תוצאות ניסוי ELISA.

3 5
טבלה 2: דוגמה לחישוב אחוז החלבון Cytochrome c בציטופלסמת התאים ביחס לכלל התא,              כפי שנתקבל מתוצאות ELISA.
36
רשימת גרפים גרף עמוד גרף 1: דוגמא לבניית עקומת הכיול על פי הסטנדרד בניסוי ELISA.
35
גרף 2:
תוצאות ניסוי הצביעה הפלואורוסצנטית של Annexin-V ו-PI בתאי Vero           המודבקים ב-S.
negevensis ובתאי ביקורת.

3 9
גרף 3: זיהוי מוות תאי על פי צביעה ב-Hoechst של גרעיני תאי Vero המודבקים           ב-S. negevensis ובתאי ביקורת, עם וללא טיפול ב-Staurosporine.
42
גרף 4:
תוצאות ELISA של ריכוז Cyt c בציטופלסמה יחסית לריכוזו בכלל התא בתאי           Vero ובתאי Hela המודבקים ב- C. trachomatisמזן L2
ובתאי ביקורת, עם           וללא טיפול ב-Staurosporine.

4 4
גרף 5: גרף מייצג של תוצאות ELISA, של ריכוז Cyt c בציטופלסמה יחסית לריכוזו             בכלל התא בתאי Vero המודבקים ב-S. negevensis ובתאי ביקורת, עם וללא                     טיפול ב-Staurosporine.
45