סמינר ראשון בביוטכנולוגיה: מעכבי חמצון טבעיים מרוזמרין ומרווה  הגשת תקציר כותרת המאמר: "Recovery Mechanism of the Antioxidant Activity from Carnosic Acid Quinone, an Oxidized Sage and Rosemary Antioxidant" Copyright © 2002 American Chemical Society Carnosic Acid נמצא במיצוי מצמחי המרווה והרוזמרין ויש לו פעילות אנטיאוקסידנטית חזקה. פעילות זו מבוססת על ריאקציה כימיקלית בה האנטיאוקסידנט מחומצן כדי למנוע חמצון של מרכיב ביולוגי הכרחי בתאים. בעיקרון, לאחר הריאקציה האנטיאוקסידנט מאבד מפעילותו.
למרות של- Carnosic Acid Quinone (תוצר החמצון של Carnosic Acid) אין פעילות אנטיאוקסידנטית, התמיסה שלו הראתה פעילות אנטיאוקסידנטית חזקה כשעמדה לאורך זמן. מטרת המאמר היא הצעת מנגנון המראה את האפשרות ש Carnosic Acid Quinone ממשיך לתרום לפעילות האנטיאוקסידנטית גם לאחר הריאקציה. לצורך המחקר הוכן בשלב הראשון Carnosic Acid Quinone בדרך הבאה: לתמיסת Carnosic Acid  באצטוניטריל (CH3CN- ממס של טווח רחב של כימיקלים עקב פרוטונים חומציים, נוזל פולרי, יעיל כשרוצים לבדוק ריאקציה לא ידועה), הוספה תמיסת ferric chloride (FeCl3-קטליזטור לריאקציות) בטמפ' החדר.
התמיסה נשפכה למים ומוצתה פעמיים בעזרת CH2CL2 (מתיל די כלוריד- מתפרק לשני רדיקלים- ליצירת תוצר מחומצן). בעזרת NA2SO4 (נתרן גופריתי- סופח מים) יובשה. השארית התגבשה כקריסטלים ויצרה  Carnosic Acid Quinone (אבקה כתומה). בשלב השני עורבבה תמיסת אצטוניטריל של Carnosic Acid Quinone (שהוכן קודם), יחד עם אצטוניטריל או כזה המהול במים (1:9) ו- Ethyl Linoleate (אסטר אתילי של חומצה לינולאית- חומצת שומן- מיועד לחיזור כימיקלים). כשמתנול שימש כממס הריאקציה, תמיסת Carnosic Acid Quinone גם נוצרה במתנול. התמיסה הודגרה ב-37 מעלות צלסיוס וממנה נלקח 1 מ"ל בתוספת -AIBN (2,2'-Azobis(isobutyronitrile או בתוספת -AMVN (2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)  (יוזמים רדיקלים ע"י פירוק). התמיסה נוערה באמבט מים, בחושך ובנוכחות אוויר. במרווחי 0.5-1 שעה נלקחה מנות והוזרקו ל-HPLC (כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה), כאשר ריכוז כל מרכיב חושב לפי איזור הפיק בעזרת עקומת כיול שנעשתה לכל מרכיב לאחר בידוד.  באותם מרווחי זמן נלקחה מנה נוספת מהתמיסה הנ"ל, והוסף לה מתנול.  HPLC שימש לניתוח כמותי של ה- Ethyl Linoleate Hydroperoxide שנוצר בתמיסה מחמצון של Ethyl Linoleate (בעזרת AMVN). כמות תוצר מחומצן בנוכחות Carnosic Acid Quinone פחותה מהביקורת (ללא Carnosic Acid Quinone) תצביע על כך שלנוכחות ה- Carnosic Acid Quinone היתה השפעה אנטיאוקסידנטית בריאקציה.
הסברת המנגנון מבוססת על ניתוח התוצרים שהתקבלו מתמיסת Carnosic Acid Quinone לשם כך, בשלב השלישי של המחקר בודדו וזיהו אותם ע"י HPLC:Carnosic Acid ,7-O-Methylrosmanol ,    Carnosic 8-lactone, Carnosol.  Rosmanol התקבל לאחר שתמיסת Carnosic Acid Quinone הומסה בתערובת אצטוניטריל ומים והודגרה בטמפ' החדר למשך 5 שעות.   ע"פ תוצאות השלב השני תמיסת האצטוניטריל ו- Carnosic Acid Quinoneהראתה פעילות אנטיאוקסידנטית חזקה למשך חצי שעה (בזמן זה היתה כמות נמוכה של תוצר החימצון Ethyl Linoleate Hydroperoxide). מתנול כממס גרם לפעילות אנטיאוקסידנטית מתמשכת יותר של 4 שעות. לעומתם, תמיסת Carnosic Acid Quinone טרייה היתה בעלת פעילות אנטיאוקסידנטית חלשה ביותר, שלא נמשכה כלל. נראה כי סוג הממס קובע כמה זמן נמשכת הפעילות. בנוסף, כאשר התמיסה אינה מודגרת די זמן אין כלל פעילות אנטיאוקסידנטית.
כלומר במשך הזמן Carnosic Acid Quinone עובר שינויים כימיים וכך, באופן עקיף, משפיע על הפעילות האנטיאוקסידנטית בתמיסה.
תוצאות אנליזת Carnosic Acid Quinone באצטוניטריל (לאחר 4 שעות) מראות שהוא אינו יציב, ומייצר מספר תוצרים (ובכך יכול להסביר את ההשפעה העקיפה). התקבלו 5 פיקים (כלומר, 5 תוצרים). האריכו את זמן הדגירה ל-8
שעות, והניתוח הראה שהפיקים גדלו לעומת Carnosic Acid Quinone, שכמותו קטנה, דבר המצביע על כך שהתוצרים החדשים נוצרו ע"י ריאקציית הפחתה בתמיסה. לגילוי תרומתם נותחו שינויי הריכוזים של כל מרכיב (שנגרמו ע"י –AIBNמעורר חמצון רדיקלי) עם ובלי AIBN. אם המרכיב הינו אנטיאוקסידנט, כמותו תפחת כתוצאה מהחמצון ותוצרי הריאקציה יצטברו. נמצא כי רק לפיק 3 ו-5 קטן הריכוז, 1 ו-2 כמעט ללא שינוי (כלומר חסרי פעילות אנטיאוקסידנטית) ואילו פיק 4 עלה בריכוזו. מאחר ו-5 היה מאוד לא יציב לא ניתן היה לבודד אותו בטכניקות שנוסו. 3 זוהה בעזרת HPLC, לאחר ניתוח מבנה ספקטרוסקופי התגלה שמדובר ב- Carnosic Acid , מצבו המחוזר של Carnosic Acid Quinone. מאחר והתרחשה עליה בריכוז חומר 4 , ייתכן והוא תוצר חמצון בריאקציה זו. ניסיון לרכז את התמיסה כשל (החומר התפרק בתהליך). ידוע שחמצון ויטמין E נותן חומר סגול, מאחר וזהו צבע חומר 4 לאחר שבודד, יתכן שנוצר מרכיב מחומצן במהלך הריאקציה. לתמיסה לא הוסף ריאגנט מחזר, לכן נלקחה בחשבון אפשרות של ריאקציית חיזור חמצון עצמית של Carnosic Acid Quinone. תוצאות אנליזת Carnosic Acid Quinone במתנול (לאחר 4 שעות): התקבלו חומרים 6-8: 7-O-Methylrosmanol, carnosol ו- Carnosic 8-lactone, בהתאמה. החומרים 3 6 7 8 ו- Carnosic Acid Quinone נבדקו עם ובלי AIBN שהוסף שעה לאחר התמוססות ה- Carnosic Acid Quinone במתנול. ריכוז Carnosic Acid קטן בהשוואה לריכוזו ללא AIBN, ריכוז Carnosol ו- Carnosic
8 -lactoneלא השתנה עם ובלי AIBN, וריכוז 7-O-Methylrosmanol גדל.בהשוואה לריכוזו ללא AIBN. בתנאים אלה ניתן להבין ש-Carnosol ו- Carnosic 8-lactoneלא תרמו לפעילות האנטיאוקסידנטית שהתגלתה (מאחר וכמותם לא פחתה- הם לא השתתפו בריאקציה- לא קלטו ולא קיבלו אלקטרון). אין כאן סתירה מאחר והידע הספרותי קובע כי קרנוזול הוא אנטיאוקסידנט חזק הלוכד רדיקלים בריאקציות Fenton, שאינו נוכח בריאקציה זו. נראה כי  7-O-Methylrosmanol הוא תוצר סיום של הריאקציה האנטיאוקסידנטית. כמות התוצר שלו הייתה שווה לכמות ייצור Carnosic Acid . לפי עקרון ריאקציית החימצון חיזור, כשנוצר מרכיב מחוזר חייבת להיווצר אותה כמות מחומצנים בריאקציה, מכאן מבינים ש Carnosic Acid Quinone עבר במתנול ריאקציית חיזור חמצון עצמית וייצר אותה כמות מחוזרים ומחומצנים. האנטי אוקסידציה של Carnosic Acid  יצרה את  Carnosic Acid Quinone, לכן, העלייה המועטה יחסית של ה- Carnosic Acid Quinoneבנוכחות AIBN יכולה להיות מוסברת ע"י הראוקסידציה של ה- Carnosic Acid המיוצר.
מעגל החימצון חיזור בין שניהם ייצר באופן מתמיד  7-O-Methylrosmanol כגורם מחמצן, וזה יכול להסביר את העלייה בריכוז ה-7-O-Methylrosmanol. קבוצת המתוקסי שמופיעה בעמדה 7 נחשדה שהגיעה מהממס. המתנול נוקלאופילי ויכול להפוך מתווך בחמצון ה- Carnosic Acid Quinone . מאחר ומים שכיחים יותר מהמתנול בצמח ובמזון, נבחנה פעילותו במים למשך 4 שעות. נצפתה פעילות אנטיאוקסידנטית חזקה למשך שעתיים, ואותם תוצרים התקבלו למעט 7-O-Methylrosmanol, ובמקומו התקבל פיק חדש מס' 9
בזמן 3.3 דקות- מתאים לrosmanol , שהוא נגזרת ה-desmethyl של ה-7-O-Methylrosmanol, בעמדה 7-O, וכבר בודד מרוזמרין ונחשב אנטיאוקסידנט חזק. ניתוח כמותי שלו מתאים ל- Carnosic Acid, ולכן מצביע על כך שרוזמנול הוא תוצר חימצוני של Carnosic Acid Quinone, המיוצר בריאקציית חיזור חימצון עצמית בנוכחות מים, בדומה ל-7-O-Methylrosmanol שהתקבל במתנול. מסקנות: Carnosic Acid Quinone חסר פעילות אנטיאוקסידנטית בריאקציות רדיקליות אך אינו יציב בתמיסה. הוא מומר לנגזרות לקטון ובריאקציות חמצון חיזור עצמיות שיוצרות רוזמנול ו- Carnosic Acid. התוצרים בעלי פעילות אנטיאוקסידנטית: Carnosic Acid , rosmanol  ו-carnosol, והם גורמים לתמיסת ה- Carnosic Acid Quinoneלהיות בעלת פעילות אנטיאוקסידנטית חזקה. סוג ההמרה תלוי בממס, כאשר פרוטי יכול למשוך את ההמרה לקרנוזול, אך עדיין ריאקציית חמצון חיזור עצמית במהותה חייבת להתרחש בתמיסה. נספח 1: מבנה                  נספח 2: תרשים המנגנון שהוצע: