תקציר בשנים האחרונות הולכת וגוברת שכיחות החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה (MDR -Multi Drug Resistant). מחקר שנערך בבתי חולים בארה"ב ובאירופה גילה כי כל שנה נדבקים כ-800,000 חולים בחיידק ה- Pseudomonas Aeruginosa (להלן "PA") וכי 50% מכלל החולים נדבקים בזיהומים דווקא בכותלי בית החולים עצמו.
חיידק ה-PA הינו חיידק גרם שלילי, הנפוץ מבין זני הפסודומונאסים הפתוגניים, והינו אחד מהחיידקים המחוללים מחלות זיהומיות בתוך בתי החולים, ביניהם דלקת ריאות וזיהומים שונים בדרכי השתן. ה-Pseudomonas  תוקף בעיקר חולים שעברו טיפולים חודרניים כגון: הכנסת קטטר, הכנסת צינור לקנה הנשימה או חיבור נוזלים לצינורות הדם. לעיתים החיידקים עלולים לחדור לזרם הדם ולגרום להרעלה (אלח דם) ובמקרים בהם הם מגיעים לריאות, הם עלולים לגרום לדלקת ריאות קטלנית. חברת "LOSTAM" אשר נוסדה ב-2009 החלה לפתח מספר נוגדנים (ממקור עכברי, כימריים והומאניים), בעלי אפניות שונה לזנים השונים של חיידק ה- Pseudomonas. מטרת המחקר הייתה לאפיין את הנוגדן ההומאני LST-007 במגוון שיטות מעבדתיות ולבחון את מידת יכולת ההיקשרות ופעולת הנוגדן על חיידקי Pseudomonas  בעלי שוטון מסוג B ((Flagellin type B. ראשית, נבחנה מידת הקשירה של הנוגדן LST-007 בשיטת ה- ELISA  לחלבון Flagellin type B. לאחר מכן נבדקה ספציפיות הנוגדן לחיידק באמצעות מספר שיטות אבחון:SDS PAGE  לשם הערכת גודלן של השרשראות המרכיבות את הנוגדן, בדיקת תנועה של החיידק לשם ראיה ויזואלית לתנועת החיידק והשפעתו על ידי הנוגדן הנחקר ובדיקת חדירה לשם בדיקת מספר התאים שחדרו לתא המאכסן. תוצאות המחקר מראות כי הנוגדן הנבחן,LST-007 , הינו ספציפי באופן מוחלט לחיידק PA Flagellin type B והוא מסוגל לזהות את החיידק בריכוז נמוך של 8pg, דבר המעיד על אפיניות גבוהה מאוד של הנוגדן. בנוסף, נמצא כי הנוגדן הנבדק לעיל מסוגל גם לעכב את תנועתיות החיידק. ואכן, כבר בתוצאות ראשוניות נראה כי הנוגדן מונע חדירת חיידקים לתאים.
המשך פיתוח הנוגדן עתיד לתת מענה לטיפול בחולים שנדבקו ב- PA ולהוות פריצת דרך לטיפול במחלות זיהומיות בעזרת נוגדנים.
Abstract A major public health crisis looms due to the dwindling pipeline of anti- bacterial drugs which are effective against multi-drug resistant (MDR) bacterial pathogen. As identified by the infectious Disease Society of America (IDSA). MDR Pseudomonas Aeruginosa (PA) is gram negative bacteria, highly worrisome, nosocomial bacterial pathogen and a major threat to the intensive care unit (ICU), especially in patients with hampered immune systems. PA causes ventilator associated pneumonia (VAP`s) and systemic bacteremia associated with urinary tract infections, burn injuries and surgical wound infections. Annually there are 800,000 PA infections in the USA and Europe with mortality rates as high as 50% in specific patients' populations.
Lostam biopharmaceuticals is developing highly specific monoclonal antibodies (mAbs) that target a critical, surface-expressed PA virulence factor called Flagellin which mediated motility and pathogenic characterization. Consequently, a fully human IgG1 mAb (LST-007) targeting PA flagellin type b was recombinantly expressed and characterized in vitro. LST-007 demonstrated a highly specific binding towards whole PA bacteria harboring flagellin type b and its recombinant counterpart. LST-007 attenuated PA motility in an equipotent manner, and markedly reduces the PA invasion to A-549 cells.
These data may support the LST-007 be valuable adjunct to the limited list of anti bacterial that can tackle MDR PA strains.
        תוכן עניינים                                                       
1 .                   מבוא. 1
1 .1                 עמידות בקטריאלית.. 1
1 .2                 הנוגדן 3
1 .3                 נוגדנים מונוקלונליים (חד שבטיים) כגישה טיפולית.. 5
1 .4                Pseudomonas aeruginosa  (PA) 6
1 .5                 השוטון- Flagellum.. 7
1 .6                 חברת "Lostam Biopharmaceuticals". 8
2 .                   שיטות וחומרים. 9
2 .1                 חומרים ותמיסות.. 9
2 .1.1                חיידקים ותרביות תאים. 9
2 .1.2                חומרים ביולוגים. 9
2 .1.3                מצעי גידול. 9
2 .1.4                בופרים. 9
2 .1.5                חומרים נוספים. 10
2 .1.6                תמיסות.. 10
2 .2                 שיטות.. 11
2 .2.1                ייצור, ביטוי וניקוי הנוגדן LST-007. 11
2 .2.2                ייצור וניקוי חלבון השוטון Flagellin Type B.. 11
2 .2.3                אלקטרו-פורזה בג'ל בשיטת  SDS-PAGE בתנאים מחזרים. 11
2 .2.4                מבחן ELISA בציפוי האנטיגןflagellin. 11
2 .2.5                מבחן Fixed ELISA.. 12
2 .2.6                זריעה וספירה. 13
2 .2.7                מבחן תנועתיות החיידק PA (motility assay) 13
2 .2.8                מבחן חדירת החיידק Invasion assay. מנהל עסקים
3 .                   תוצאות.. משפטים
4 .                   דיון ומסקנות.. 23
4 .1                 אפיניות וספציפיות הנוגדן 23
4 .2                 יכולת הנוגדן LST-007 להיקשר לחיידק השלם. 24
4 .3                 תנועתיות החיידק PA.. 24
4 .4                 חדירות החיידק לתאים Invasion assay. 24
5.                   ביבליוגרפיה. 26
טבלאות טבלה מס' 1- חיידקים העמידים לטווח רחב של תכשירים אנטיביוטיים 1
טבלה מס' 2- רשימת תמיסות –10 איורים איור מס' 1- ייצוג סכימטי של מולקולת נוגדן -.4
איור מס' 2- תאור ה-Flagella של חיידקים גרם שליליים …7
איור מס' 3- פרופיל הנוגדן LST-007 כפי שמוצג ע"י צביעה של ג'ל ב-Coomasie blue -..משפטים גרפים גרף מס' 1- קישור הנוגדן LST-007 לחלבון ה- FLA-B בשיטת ELISA –16  גרף מס' 2- קישור הנוגדנים LST-007 ו-LST-001 לחלבון ה- FLA-A ב- ELISA –.17
גרף מס' 3- קישור הנוגדן LST-007  לחלבון flagellin type b  בשני ריכוזים שונים -..18
גרף מס' 4- קישור הנוגדן LST-007 לחיידק   Pa01(FLA-B) ו-PA9721 (נטול השוטון …19
גרף מס' 5- מבחן תנועתיות החיידק PA בריכוזים עולים עד 20µg/ml לאחר 18 שעות אינקובציה-20 גרף מס' 6- השוואת תנועת החיידק בין 24 שעות (קו כחול) לבין 48 שעות (קו אדום) בריכוזים שונים (mm) –..21
גרף מס 7- חדירת החיידקים לתוך תאי A-549 מפוצצים, לאחר טיפול ב-LST-007 40µg/ml, בהשוואה לתאים שלא עברו טיפול .21
רשימת קיצורים CHO                       Chinese hamster ovale  CF                           Cystic fibrosis     FLA-A/B           Flagellin Type A or B IDSA                      Infection disease society of America IgG                         Immunoglobulin G Lps                         Lipo poly saccharide mAb                      Monoclonal Antibody MDR                      Multi Drug Resistant MDRO`s               Multi Drug resistant organisms OD                          Optical Density PA                          Pseudomonas aeruginosa PLL                         Poly-L-Lysine TLR5                       Toll like Receptor
1 .      מבוא

1 .1   עמידות בקטריאלית זיהומים הנרכשים בבתי החולים (health care-associated infections), נחשבים כיום לסיבוך השכיח ביותר המשפיע על חולים מאושפזים. כעשרה אחוזים מבין החולים המתאשפזים בבתי החולים "רוכשים" בזמן שהותם זיהום שלרוב נגרם על ידי חיידקים העמידים לטווח רחב של תכשירים אנטיביוטיים MDRO’s- multi drug resistant organisms)) (טבלה מס' 1). תופעה זו משפיעה על כשני מיליון איש בשנה בארצות הברית, עם תמותה של כ-90,000 איש בשנה ותוספת הוצאה שנתית של כחמישה מיליארד דולר על הטיפול בחולים אלו.
                  טבלה 1 : חיידקים העמידים לטווח רחב של תכשירים אנטיביוטיים בשנים האחרונות הולכת וגוברת השכיחות לחיידקים העמידים בפני אנטיביוטיקה בשל הידלדלות חדה בתרופות אנטי-בקטריאליות היעילות כנגד חיידקים גרם שליליים ובתוכם חיידקים פתוגנים המובילים לשיעורים גבוהים בתמותה ובתחלואה. בבתי חולים מאושפזים אנשים מסיבות שונות: מחלה, פציעה, לידה ועוד. במקרים רבים, לוקים המתאשפזים במחלה נוספת, זיהומית, שלגורם לה הם נחשפו בכותלי בית החולים. מחלות אלו נקראות מחלות נוזוקומיאליות (Nosocomial- שילוב של צמד מילים ביוונית: nosus- מחלה, komeion- מטפלים). החיידקים העיקריים הגורמים למחלות נוזוקומיאליות הם: Acenitobacter baumanii, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis ו- Clostridium difficile . החוקר Jian Vincent ועמיתיו הצליחו להראות כי ישנו קשר חזק בין נוכחותו של זיהום בחולה לבין משך שהותו ביחידה לטיפול נמרץ וכן, שכיחותם הרבה של חיידקים עמידים סביבתיים כדוגמת ה- Pseudomonas  . הגורמים למחלות נוזוקומיאליות, כמו במחלות זיהומיות אחרות, הם חיידקים, נגיפים, פטריות ובמקרים נדירים יותר חד-תאיים או פרוטיסטה, אשר רובם אינם גורמים למחלות באנשים בריאים. מחקרים רבים מתעדים הן את העלייה בשכיחות הזיהומים במחלקות לטיפול נמרץ והן את העלייה בשיעורי העמידות האנטי-מיקרוביאלית; למעלה מ- 70% מהזיהומים של בתי החולים נגרמים בעקבות עמידותם של אורגניזמים שונים לתרופה אחת או יותר.  הגורמים העיקריים התורמים לגידול הזיהומים בסביבת בית החולים הינם…