חיידקים בתעשייה ייצור פעילי שטח ע"י מיקרואורגניזמים תוכן:
פרק 1:   מבוא                                                                                                                             2
פרק 2:   הגדרות וקלסיפיקציה של פעילי שטח ממקור החי (Biosurfactants)                                          2
פרק 3:  עקרונות בסיסיים של ייצור של פעילי שטח (Biosurfactants)                                                    5                פרק 4:  יישומים של Biosurfactants                                                                                              
6                                                                                 (הסבר בסיסי על יישומים שונים של פעילי שטח בתחומים שונים כגון תעשייה,             חקלאות, איכות הסביבה, ייצור מזון, רפואה)      4.1  שימוש פוטנציאלי של פעילי שטח (Biosurfactant ) בביו – רפואה ותעשייה פרמצבטית                7                                                                                                                           4.1.1 פעילות אנטימיקרוביאלית של פעיל שטח (Biosurfactant) המיוצר                     ע"י Bacillus licheniformis שגדל במי גבינה                                                                
1 0                                (כולל תנאי ייצור של פעיל שטח, מהלך ניסוי ובדיקות, תוצאות ומסקנות)     4.2 שימוש בפעילי שטח בתעשיית מזון                                                                                       משפטים                                                                                4.2.1 ספיחה של Biosurfactant על משטחים על מנת שיפור חיטוי של משטחים מזוהמים עם                    Listeria monocytogenes.                                                                                         משפטים           פרק 1
          מבוא:
פעילי שטח ממקור חי מיוצרים ע"י מיקרואורגניזמים שגדלו על סובסטרט מימי או שומני. הם או נדבקים למיקרואורגניזם או נפרשים לתוך התרבית. יש להם תכונות מיוחדות של הקטנת שטח פנים ומתח ביניהם, הפחתת מידת ספיגה (bioavailability) של חומרים לא מסיסים במים, קישור מתכות כבדות ע"י שימוש במכניזמים שדומים לפעילי שטח כימיים, פעילות אנטיבקטריאלית ועיכוב ייצור של בייופילים. מרכיבים פעילי שטח מיוצרים ע"י מיקרואורגניזמים של שני סוגים, אלה שמקטינים מתח פנים (Biosurfactants) ואלה שמקטינים מתח בין חומרים שלא ניתן לערבב ביניהם (Bioemulsifiers).
פרק 2
קלסיפיקציה של Biosurfactants:
קלסיפיקציה של פעילי שטח ממקור חי מבוססת בעיקר על הרכב כימי וייחודיות מיקרוביאלית.
פעילי שטח מחולקים ל- 5 קטגוריות בהתאם למבנה של חלק הידרופילי שלהם:

1 . גליקוליפידים (Glycolipids)
2 . ליפופטידים (Lipopeptides)
3 . חומצות שומן (Fatty acids)
4 . פולימרים (Polymers) 5. פעילי שטח חלקיקיים (Particulate biosurfactants) פרק 3
ייצור פעילי שטח:
קינטיקה של ייצור ביוסורפקטנטים מפגינה וריאציות רבות בין מערכות שונות. פרמטרים של ייצור ביוסורפקטטנטים מחולקים לקבוצות הבאות: –  גידול שתלוי בקשור בין סובסטרט וייצור של ביוסורפקטנט (growth-associated production).
–  ייצור בתנאי גידול מוגבלים (production under growth-limiting condition) מאופיין בעלייה חדה של    רמת ביוסורפקטנטים כתוצאה של הגבלת אחד או כמה מרכיבים של מצע גידול.   –  ייצור בעזרת תאים משותקים או נמצאים במנוחה (production by resting or immobilized cells).
   בייצור זה תאים של חיידקים לא מתרבים, אבל למרות זאת ממשיכים לנצל פחמן לסינתזה של ביוסורפקטנט.
–  גידול עם הוספת פרקורסור (production with precursor supplementation). הוספת של פרקורסור    לתמיסת גידול גורמת בו זמנית לשינוי איכותי וכמותי במוצר.
פרק 4
יישומים של Biosurfactants:
לפעילי שטח גם ביולוגיים וגם כימיים יש תפקיד חשוב מאוד ב- oil recovery וביוריפוי של מזהמים.
טבלה מס' 2
יישומים של Biosurfactants:
תחום יישומים פעילות תעשיית נפט הגברת oil recovery De- emulsification Biosurfactants ופעילי שטח כימיים יכולים להגביר פסאודו מסיסות של קומפוננטים של נפט במים. סביבה ביוריפוי (Bioremediation) ביוריפוי חקלאות בקרה ביולוגית הכוונה של בקרה ביולוגית היא להשתמש במיקרואורגניזמים מובחרים תוך כדי שימוש בתכונות הטבעיות שלהם נגד אורגניזמים מזיקים.
מזון תהליכי תחלוף וביטול תחלוף.
מרכיבים פונקציונליים בפעילי שטח ממקור חי משתמשים בתעשיית מזון כאמולסיפיירים, ממיסים, מבטלי תחלוף, הרטבה , הקצפה, חומרי נגד הקצפה, מסמיכים.
ביולוגיה מיקרוביולוגיה פרמצאוטיקה ותרפיה קוסמטיקה (מוצרי טיפוח ובריאות) השפעה על התנהגות פיזיולוגית כמו ניידות של תאים, תקשורת בין התאים, הוספת חומרים מזינים, פתוגנזה בעולם החי.
ל-biosurfactants יש תכונות בולטות כגון:
אנטיבקטריאליות, אנטיוירליות, אנטיפטרייתי, גורמי הדבקה, השפעה על מערכת החיסונית. משתמשים בפעילי שטח כמרכיבים עיקריים בייצור מוצרי קוסמטיקה:
אמולסיפיירים, גורמי הקצפה, חומרי ניקוי, מסמיכים, גורמים אנטי בקטריאליים, מתווכים בין ריאקציות אנזימטיות.
ביו תהליכים Downstream processing משתמשים בהם ביוקטליזטורים במערכות מימיות המורכבות משתי פאזות ובמיקרו אמולסיות, biotransformations, הגברת ייצור של אנזימים חוץ תאיים ומוצרי תסיסה.
 4.1  שימוש ב-Bisurfactants ברפואה:
      בפעילי שטח ממקור חי (Biosurfactant) משתמשים בתחומים רבים ברפואה:
      טבלה מס' 3
      דוגמאות ליישום בביוסורפקטנטים ברפואה              סיכום:
 Bosurfactants  כגורמים פעילים מהווים אלטרנטיבה לרפואה סינטטית ותרכובות אנטיביוטיות, יכולים       להיות בשימוש כמרפים יעילים, במיוחד בזמן שקיימים הרבה זנים עמידים לתרופות נגד מחלות מסכנות חיי אדם.
      למרות פוטנציאל אדיר של פעילי שטח ממקור חי בביו רפואה, השימוש בהם עדיין לקוי בחסר, בעקבות המחיר       הגבוה של ייצורם, מידע מועט וטוקסיות לא ברורה כלפי גוף האדם. אחרון ולא פחות, המכניזם של עמידות של  surfactin      חייב להיות הוסבר. מחקרים עתידיים על תאי אדם ומיקרואורגניזמים חייבים להיות תקפים בשימוש       של Biosurfactants   בביו רפואה ותחומים אחרים שקשורים לבריאות האדם.
למרות הכול זה עניין של זמן עד       לשימוש מלא בפעילי שטח מקור חי וניצול מלא שלהם ברפואה.
.1.1 פעילות אנטיבקטריאלית של פעיל שטח המיוצר ע"י Bacillus licheniformis שגדל במי גבינה.
       מבוא:
       מי גבינה הוא תוצר נוזלי של ייצור הגבינה המכיל את הרכיבים המסיסים במים. מי גבינה מורכב מרמות גבוהות        של לקטוז (75% אחוז של חומר יבש),
1 2-מנהל עסקים% של חלבון, ובנוסף חומצות אורגניות, מינרלים וויטמינים.
       סילוק מי גבינה מהווה ביעה של זיהום מרכזי, במיוחד במדינות עם משק חלב גדול. מחקר הזה מראה איך מי          חומרים ושיטות:
      2. תנאים ומצעי גידול:
      א. תרבית טרייה של B. licheniformis הועברה ל- peptone yeast glucose medium והודגרה לאינקובציה.           אחרי זה תרבית הועברה ל- MSM ומי גבינה כמקור לפחמן.
      3. הפקת biosurfactant בעזרת צנטריפוגה ושיקוע עם HCl.
      4. בחינה של פעילות אנטימיקרוביאלית:
      5. קביעת ריכוז עיכוב מינימלי:.
       6. השפעת biosurfactant על צמיחה ומרכיבים תאיים של Staphylococcus aureus, ATCC
5 928:
            תוצאות ודיון:
     1. עשרה זנים של חיידקים אלה שבודדו מקרקעות מזוהמות בנפט ברמות שונות של זיהום ונאספו מאתרים שונים          ממדבר מערבי של מצרים. בעקבות שיטה  "Qualitative drop-collapse" זוהה זן שמייצר  biosurfactant         , Bacillus licheniformis M104, והוא נבחר למחקר.
     2. ייצור של פעיל שטח תלוי בסוג מקור של פחמן שנמצא במצע גידול         Davis et al. 1999; Adamczak and Bednarsk
2 000) ).          במחקר זה, מי גבינה שימש לייצור  biosurfactant, שמהווה מקור זול לפחמן עבור גידול חיידקים. מי גבינה          כסוג של פסולת אמור להיות סובסטרט יותר טוב יחסית לייצור biosurfactant בהשוואה למצעי גידול סינטטיים.          יתר על כן, הפוטנציאל בשימוש ב- Whey  מספק ניהול יעיל בשפכים של תעשיית חלב (Patel and Desai. 1997; Dubey and Juwarkar 2001; 2004) .                                                                                                   3. במחקר הנוכחי biosurfactant  ליפופטידי במיוצר ע"י זן B. licheniformis M104 הפגין פעילות מיקרוביאלית         מעניינת.  בטבלה מס' 4 רואים שכל המיקרואורגניזמים שנבדקו היו רגישים ל-biosurfactant, למעט חיידק         גראם חיובי (L. monocytogenes) וחיידק גראם שלילי (K. pneumonia) שהראו עמידות ל-biosurfactant.
          �         4. S. aureus היה זן הכי רגיש ל- biosurfactant. התוצאות האלה התאימו גם לדיווח של Singh ו-Cameotra        על ליפופטיד המיוצר ע"י B.subtilis שהיה פעיל נגד מספר מיקרואורגניזמים, במיוחד S. aureus.
               5.1.  גרף מס' 1- השפעה של biosurfactant לרמת צמיחה של Staphylococcus aureus ATCC
5 928.
       5.2 גרף מס' 2 – השפעה של biosurfactant על חומצה תאית שמסיסה זרחן בתאים של Staphylococcus aureus ATCC
5 928                         .   5.3 גרף מס' 3 – השפעה של biosurfactant על כמות סה"כ שומנים בתאים של Staphylococcus aureus                          ATCC
5 928.            5.4 גרף מס' 4 –  השפעה של biosurfactant על כמות סה"כ חלבונים בתאים של Staphylococcus aureus                            ATCC
5 928 .         5.5
גרף מס' 5 – השפעה של biosurfactant על כמות סה"כ RNA בתאים של  Staphylococcus aureus,                    ATCC
5 928 .
גרף מס' 6 – השפעה של biosurfactant על כמות סה"כ DNA בתאים של  Staphylococcus aureus,                   ATCC
5 928.

6 . לסיכום, תוצאות המחקר הראו ש-biosurfactant המיוצר ע"י B. licheniformis M104 בגלל התכונות     הביולוגיות שלו מציג פוטנציאל גדול בתחום ביוטכנולוגיה ואישומים בביורפואה.  4.2 שימוש ב- Biosurfactants  בתעשיית מזון:
         רוב האישומים בפעילי שטח בתעשיית מזון הם בסילוק מזהמים, בשימוש בהם כמרכיבים מיקרוביאליים בתהליכי        הקצפה, ייצור אמולסיות, הסמכה, הרטבה (Banat et al., 2000), כחומר שמונע הדבקה של מיקרואורגניזמים        למשטחים והשפעה אנטיבקטריאלית שלהם (Singh & Cameotra, 2004).
       ליפופטיד שהופק מ-B.subtilis יכול ליצור אמולסיה יציבה עם שמן סויה ושומנים של קוקוס ומשתמש כגורם        לייצור אמולסיות בתעשיית מזון (Nitschke & Pastore, 2006).
     Manoprotein   ההופק מ- Kluyveromyces marxianus היה יציב בתוך אמולסיה עם שמן תירס במשך 3
       חודשים שנותן אפשרות ליישומים פוטנציאליים בתור ביואמולסיפייר (Lukondeh, Ashbolh, & Rogers, 2003).
       חוץ מהיכולת של פעילי שטח להקטין את לחץ של פני השטח, יצירה ויציבות של אמולסיות , לפעילי שטח יש        עוד כמה פונקציות בתעשיית מזון.
למשל בקרה אגירה של גושי שומן, לייצב מערכות מאווררות, שיפור מרקם        וחיי מדף של מוצרים מכילים עמילן.       
4 .2.1  ספיחה של biosurfactant על ​​משטחים כדי לשפר את חיטוי המשטחים המזוהמים עם           Listeria monocytogenes.
        מבוא:
      אם מידת היגיינה לא מיושמת כהלכה בתעשיית מזון, הדבר יכול להוביל לבעיות כלכליות בשילוב עם סכנה לבריאות           הציבור. מחקרים רבים מראים שמיקרואורגניזמים הנמצאים בשטח במפעלי מזון מהווים מקור של זיהום המוצרים       והפצת מחלות.
              חומרים ושיטות:
       תנאים ומצעי גידול של L. monocytogenes LO28:
       הפקה ובידוד של biosurfactant:
               לתנאים מקדימים והכנת משטח השתמשו בחומרים למשטחים שנפוצים מאוד בתעשיית מזון שהם                   בוצע מבחן של יעילות הדבקה:
       בוצע מבחן של יעילות חיטוי:
            הסבר תוצאות:
            כל טסט בוצע בטריפליקט עם 3 תרביות שונות (סה"כ 9 טסטים).
            הערכה של יעילות חיטוי נקבעה ע"י ריכוז המינימלי בקטריוצידי , שאמור להוריד מספר החיידקים לפחות             ב- 5 log אחרי 5 דק' של מגע עד לריכוז גבוה מ- 105
CFU/ml-1.
            נקבע גם אחוז של תאיים מתים (Killed cells, KC%) בעזרת משוואה:              KC% = (1- n/N)x 100             N – מס' חיידקים בביקורת חיובית,  n- מס' חיידקים אחרי חיטוי.
תוצאות ודיון        מבחן חיטוי על planktonic cells:
            קביעת השפעה של טיפול מקדים של משטח ב-biosurfactant בהקשר של תגובה של תאים מודבקים של             L. monocytogenes בטיפול בתמיסת חיטוי, מאוד חשובה בהערכה של חיטוי של planktonic cells.                      גרף מס' 7- פעילות בקטריוצידית של Sodium Hypochlorite ו- Peracetic acid על L.monocytogenes                              בריכוזים104, 105, 108 CFU/ml-1
 (20°C – סימנים שחורים, 37°C – סימנים לבנים).
            גרף מראה סה"כ מספר תאיים מושמדים בטווח ריכוזים של תמיסות חיטוי מ- 0.61 עד 1.23 ppm             של NaOCl ו- ≥5.13 ppm Peracetic Acid  במגוון של ריכוזים התחלתיים של חיידק.
     שוני בפרופילים תלוי בריכוז של החיידק בתגובה לתמיסת חיטוי. אין השפעה של טמפרטורה שבה גדל החיידק.                 ערכים זהים של MBC (ריכוז הבקטריאוצידי המינימלי) של 0.61 ppm התקבלו עם חיידקים עם ריכוזים             105, 108
CFU/ml-1, כך התקבלה פעילות בקטריאוצידית בשני הריכוזים האלה.
            עם אותו ריכוז של חומר חיטוי לא נמצאו תאים ששרדו כשמספר התחלתי של תאי החיידק היה 104
CFU/ml-1,             כפי שניתן היה לצפות (גרף מס' 7
A).
           עם Peracetic acid/ Hydrogene peroxide נצפתה פעילות בקטריוצידית יותר חזקה בריכוז של חיידקים           105
CFU/ml-1  , נמצא ריכוז בקטריוצידי מינימלי (MBC) של 5.13 ppm PA בהשוואה עם ריכוז של           108
CFU/ml-1  שעבורו לא נמצא MBC.            גם כמו עם NaOCl, לא שרדו תאיים אחרי טיפול בחומצה פראצתית בריכוזה 5.13 ppm בתרחיף שריכוזו            התחלתי 104
CFU/ml-1  (גרף מס'7 B ).
               גרף מס' 8 – השוואת פעילות בקטריוצידית על planktonic cells ו-adherent cells על משטח לא מוכן.             לא משנה באיזה סובסטרט השתמשו, עקומות ל-planktonic cells ולתאים שהודבקו,             נראות שונות. במקרה של תאים בתרחיף (planktonic cells), עקומות הראו פעילות בקטריוצידית מאוד             חלשה בריכוזים נמוכים של תמיסות חיטוי, ואחריו ירידה מהירה המובילה לביטול פעילות של כל התאים             ברגע שריכוזים של תמיסות חיטוי עולות.
                       טבלה מס' 5
           פעילות בקטריוצידית של NaOCl ו- Peracetic acid/Hydrogen peroxide על L. monocytogenes            המודבקים על נירוסטה או PTFE.
   PAH NaOCl Material
3 7 °C
2 0 °C
3 7 °C
2 0 °C KC% RF KC% RF KC% RF KC% RF 99.90
3 .0 99.98
3 .7
99.99
4 .0 99.99
4 .0 Stainless steel 99.90
3 .0 99.98
3 .7
99.96
3 .4
99.96
3 .4
PTFE RF – reduction factor, KC% – % killed cells                    גרף מס' 9 –  השוואת אפקט בקטריוצידי על תאים מודבקים (adherent) של L. monocytogenes על                                משטחים מטופלים או לא מטופלים עם  .
biosurfactant                           ניתן לראות שהושמדו כ- 100% של חיידקים מודבקים על משטחים שטופלו ב-biosurfactant              בשימוש גם NaOCl וגם PAH, מלבד פעילות של pAH על תאים ב- 37 °C. במילים אחרות, tensioactive              מולקולות שנספחו על נירוסטה לא משחקים את התפקיד של חומרים מפריעים.
             סיכום     התוצאות שהתקבלו במחקר זה הוכיחו כי היעדר מוחלט של חומרים מזינים העדיף את הפעולה של     חומרי חיטויNaOCl  ו-PAH על תאי plactonic עם יוצאי מהכלל תאים שהודבקו ,וטיפול מקדים     של משטחי נירוסטה מקטין את זיהום המיקרוביאלי שלהם. חשוב לציין  שאפקט הזה לא נצפה עם     משטחי PTFE.
    וכך, למשטח מטופל להיות אפקטיבי ולהגביל את תופעות desorption, נראה חיוני, שזה מוסבר     על ידי קשרים חזקים בין המרכיב הפעיל שטח ואת הסובסטרט. לבסוף, מחקר זה הראה גם כי     תאים המודבקים על משטחים לא מטופלים הציגו עמידות מוגברת לפעולה של חומרי חיטוי שנבחרו     בהשוואה ל-planktonic cells  , כי עמידות זו פחתה במידה ניכרת במקרים שבהם משטחי     נירוסטה היו מטופלים מראש עם  biosurfactant.
מקורת:
A. Singh, J. D. Van Hamme, O. P. Ward.
Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances.
5 :99-121 2007.
E. Z. Gomaa. Antimicrobial activity of a Biosurfactant  produced  by Bacillus licheniformis Strain M104
grown on whey. Brazilian Archives of Biology and Technology. 56:
5 9-268 2013. E. Gharaei-Fathabad. Biosurfactants in Pharmaceutical Industry: A Mini-Review.
 American Journal of Drug Discovery and Development. 1:58-69 2011. G. Seydlova, J. Svobodova. Review of surfactin chemical properties                                                          and the potential biomedical application.
Central European Journal of         Medicine.
3:123-133 2008.  J. D. Desai, I. M. Banat. Microbial Production of Surfactants and Their Commercial  Potential:
Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61:47-64 1997.
L.R. Rodrigues, J.A. Texeira. Biomedical and therapeutic applications of Biosurfactants.
Biosurfactants R. Sen (ed). Landes Bioscience. 75-87 2010.
  N. Nitschke, S.G.V.A.O. Costa. Biosurfactants in food Industry. Trends in Food Science & Technology. 18:
5 2-
5 9 2007.
T. Meylheuc, M.Renault, M.N. Bellon-Fontaine. Adsorbtion of a biosurfactant on surfaces to enhance the disinfection of surfaces contaminated with Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology.109:71-78 2006.