פיתוח מבחן לגילוי מוקדם של חידקי ליסטריה במזון
סוג העבודה | מבחן |
מקצוע | ביולוגיה |
מילות מפתח | אנגלית, ביוסנסור, חיידקים, ליסטריה, מזון, פתוגנים |
שנת הגשה | 2004 |
מספר מילים | 16257 |
מספר מקורות | 129 |
תקציר העבודה
תקציר מערכת אבחנתית פותחה לשם ניטור נוכחות של חיידק מזון גורם מחלות, Listeria monocytogenes . התפרצויות חוזרות ונשנות של מחלת הליסטריוזיס יצרו חקיקה נוקשה הדורשת מערכות אבחון טובות יותר המסוגלות לגלות נוכחות חיידק זה בדוגמאות מזון. המבחנים הקיימים כיום מסתמכים על שיטות קלאסיות של גידול וזריעה על גבי צלחות פטרי, בד"כ בשילוב של היברידיזציה של דנ"א או PCR. זמן מינימאלי של 48
שעות נדרש לשם השגת תוצאות, ולכן אילוץ זה של זמן דורש מציאת פתרונות חלופיים אשר יתנו רגישות גבוהה, קלות ביצוע יחד עם אחוז גבוה לתשובה מהימנה, וכל זאת בזמן קצר ככל האפשר. מערכת אבחון זו מביאה שילוב של תחום ההנדסה הגנטית יחד עם הפרדה מגנטית מוצעת בעבודה זו.
מבחן זה מורכב משני אלמנטים, מכשיר לומינומטר המאפשר גילוי רמות אור נמוכות וערכה חד-פעמית. הערכה מחברת בין נוגדנים ייחודיים לחיידק על גבי חלקיקים מגנטים.
הנוגדנים נקשרים לחיידקים בתוך תמיסת ההעשרה, ולאחר הפרדה מגנטית הקומפלקס של חלקיק-נוגדן-חיידק מוכנסים לתוך תמיסה של בקטריופאג'ים ספציפיים לחיידק Listeria monocytogenes והמכילים גן לאנזים לוציפראז . לאחר מספר שעות נוכחות או אי נוכחות של החיידק נבדקת ע"י תהליך פליטת אור הנוצר בעקבות הוספת שני סובסטרטים, אלדהיד ארוך שרשרת וחומר כימי רב השפעה נוסף, נתרן אזידי (NaN3).בעבודה זו בחנו את המערכת כנגד דוגמאות מזון שונות.
העבודה באנגלית Table of Contents:
1
Introduction 6
1 .1 The problem … 6
1 .2 The history of the discovery of the organism 8
1 .3 Taxonomy … 9
1 .4 Morphology . 10
1 .5 Ecology . 10
1 .6 Serology . 11
1 .7 Pathogenesis cycle –.. 13
1 .8 Virulence factors 15
1 .8.1 Adherence and invasion 16
1 .8.2 Listeriolysin (LLO) 17
1 .8.3 Catalase and super oxide dismutase 18
1 .8.4 Actin Polymerization 18
1 .9 Methods of detection — 19
1 .9.1 Conventional methods 19
1 .9.2 Biochemical tests 21
1 .9.3 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) — 24
1 .9.4 Immuno-magnetic- separation
5
1 .9.5 Molecular methods 27
1 .9.6 Luciferase phage assay 29
1 .9.7 Biosensors 29
1 .9.8 Method summary 30
1 .9.9 Immuno-magnetic phage separation 31
1 .9.10 The bacterial luminescence system 32
1 .9.11 The detection of bacteria by bacteriophage recognition — 35
1 .9.12 The use of the lux system for the detection of bacteria –… 36
2 Work objectives . 38
3 Materials and methods -.. 39
3 .1 Materials . 39
Chemicals . 39
Bacteria list 40
3 .1.1 Medium preparation 41
3 .1.2 Buffers: 43
3 .2 Work procedures 45
3 .2.1
Growth of Bacteria 45
3 .2.2 Bacteriophage propagation 46
3 .2.3 Detection of Listeria monocytogenes using magnetic-immuno-phage assay -.. 48
3 .2.4 Listeria monocytogenes detection in food samples using the magnetic immuno-phage assay (MIPA) 50
3 .2.5 Microscopy 51
4 Results .. 52
4 .1 Optimization Rationale – 52
4 .1.1 Bacterial growth 52
4 .1.2 Bacteriophage incubation time determination –… 53
4 .1.3 Bacteriophage titer determination 54
4 .1.4 The effect of aldehyde on the light output -.. 55
4 .1.5 The effect of sodium azide (NaN3) on light output -.. 56
4 .1.6 The sensitivity of the system 57
4 .1.7 The specificity of the system 58
4 .2 Application of the system in real food samples — 60
4 .3 Microscopy . 63
4 .3.1 SEM microscopy 63
4 .3.2 Fluorescence microscope 64
5 Discussion –.. 65
5.1 Artificially contaminated food samples -.. 66
5.2 Naturally contaminated food samples — 67
5.3 Future research 68
6 References –.. 69