חלק נרחב מהתרופות הקיימות מושתתות על רכיב פעיל בעל כיראליות מוגדרת. רכיבים אלו לרוב מורכבים מפפטידים בעלי חומצות אמינו כיראליות. בתהליך הסינתזה של התרופות, המיועדות לפעול למניעת קרישת דם ולטיפול בהרטבת לילה לילדים, יכול להיווצר אי-ניקיון בפפטיד, כגון: רצימיזציה של חומצה אמינית ברצף הפפטיד. בכדי לקבל פפטיד בדרגת ניקיון גבוהה (מעל 95.0%), יש לנקותו ולהפרידו מאי-ניקיון זה.
חומצות האמינו עליהן מתבסס מחקר זה מהוות חלק מרצף של שני פפטידים המשמשים כחומרים פעילים בתרופות הנ"ל.
במהלך המחקר נבדקו שיטות הפרדה לתערובות רצמיות של חומצות אמינו מוגנות בעזרת HPLC בעמודות Chirobiotic T וChiralPak QN –AX -, המכילות רכיב כיראלי המסייע בהפרדת התערובת ע"י אינטראקציות עם האננטיומרים.
נערכה השוואה בין שיטות ההפרדה בשתי העמודות ונבחרה העמודה ChrialPak QN – AX אשר לה רגישות הפרדה גבוהה יותר: בעזרתה ניתן להפריד 6 מתוך 6 חומצות אמיניות לעומת 2 מתוך 6 חומצות אמיניות בעמודה Chirobiotic T. עבור Fmoc-Tyrosine(tBu)-OH ו- Fmoc-Leucine-OH נכתבה שיטה הכוללת את תנאי הכרומטוגרפיה הבאים: עמודה  ChrialPak QN – AX, הפאזה הניידת היא v/v))98% מתנול, v/v))2% חומצה אצטית  ו w/v))0.5% אמוניום אצטט, אורך גל nm
5 4, ספיקה ml/min1, טמפ' Cº
5 , נפח הזרקה של ul5, ריכוז דוגמה mg/ml0.7 עבור Fmoc-Leucine-OH ו mg/ml2 עבור Fmoc-Tyrosine(tBu)-OH .
Abstract Vast portion of the existent medications are founded on an active component possessed of defined Chirality. During the synthesis procedure of medicine designated to withhold Coagulation and urinary incontinence treatment in children, a non cleanliness might emerge in the peptide, such as: racemic mixture of amino acid in the peptide sequence. In order to achieve high degree peptide cleanliness (above 95.0%), it must be differentiate and clean from the above-mentioned non cleanliness.
Amino acids that this research is based on constitute a segment from 2 peptides that are being used as an active substance in the above mentioned medicines.
Separation methods for protected amino acids using HPLC have been tested during this study in Chirobiotic T and ChiralPak QN –AX columns consisting of chiral component contributory separating the mixture via interaction with the peptide enantiomers.
Comparison have been made between the above mentioned columns methods and ChrialPak QN – AX column which has a higher separating sensitivity been chosen: 6 out of
6 amino acids can be separate by it compared with 2 out of 6 amino acids by Chirobiotic T column. For Fmoc-Tyrosine(tBu)-OH and Fmoc-Leucine-OH a method has been written containing the following chromatography conditions: ChiralPak QN – AX column, the mobile pahsae is :98%(v/v) Methanol, 2%(v/v) acetic acid and 0.5%(w/v)  ammonium acetate, wave length
5 4nm, flow rate 1ml/min, temperature
5 degrees Celsius, injection volume 5ul, 0.7mg/ml sample concentration of Fmoc-Leucine-OH and 2mg/ml of Fmoc-Tyrosine(tBu)-OH.
תודה!!! רשימת קיצורים FMOC-                    9FluorenylMethoxyCarbonyl HPLC- High performance liquid chromatography MPA- Mobile phase A MPB- Mobile phase B RL- Reporting level PMC                       – a 2, 2, 5, 7,
8 -PentaMethylChroman-6-Sulfonylgroup tBoc –                      a tertiary ButyloxyCarbonyl group tBu –                     a tertiary Butyl group Trt-                       aTriphenylMethylgroup תוכן עניינים
1 .                   מבוא. 1
1 .1                 חברת נוביטייד בע"מ. 1
1 .2                 פפטידים. 1
1 .2.1                סינתזה כימית של פפטידים. 1
1 .3                 כיראליות.. 3
1 .4                שיטות להפרדת אננטיומרים על בסיס כיראליות.. 3
1 .4.1                הגישה הלא ישירה. 3
1 .4.2                הגישה הישירה. 4
1 .4.3                כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה. 4
1 .4.4                כרומטוגרפיית גז. 4
1 .4.5                כרומטוגרפיית שכבה דקה. 4
1 .4.6                אלקטרופורזה קפילרית.. 4
1 .5                 הפרדת אננטיומרים בגישה הישירה ב-HPLC עם שימוש בעמודות כיראליות.. 5
1 .5.1                Polysaccharides. 5
1 .5.2                Macrocyclic Glycopeptides (Chirobiotic) 5
1 .5.3                Cyclodextrins. 5
1 .5.4                Cyclofructans. 5
1 .5.5                חלבונים. 5
1 .5.6                Chiral Ligand Exchange. 5
1 .6                 שימוש בקולונות כירוביוטיות להפרדת אננטיומרים. 6
1 .6.1                Chirobiotic T.. 6
1 .6.2                ChiralPak QN-AX.. 7
1 .6.3                Chirobiotic TAG.. 7
1 .6.4                Chirobiotic V.. 8
2 .                   מהלך העבודה. 9
2 .1                 בחירת ממס בהתאם לקולונה ולשיטה. 10
2 .2                 בחירת אורך גל אופטימאלי לדוגמה הנבדקת.. 10
2 .3                 בחירת ריכוז אופטימאלי לעבודה. 10
2 .4                 ויסות הריכוז להתאמת נפח הספיקה של העמודה. 10
2 .5                 מציאת נפח הזרקה של הדוגמה. 10
2 .6                 בדיקת השפעת פרמטרים פיסיקליים על ההפרדה. 10
2 .7                 קביעת פרמטרים של התאמת המערכת.. 11
2 .8                 אימות יציבות המערכת.. 11
3 .                   חומרים ושיטות. 12
3 .1                 חומרים. 12
3 .1.1                חומצות אמינו 12
3 .1.2                בופרים, מלחים וממסים. 12
3 .2                 שיטות.. 13
3 .2.1                סריקה ראשונית (Screening) 13
3 .2.2                שיטת הפרדה עבור Fmoc-tyr(tBu)-OH.. מנהל עסקים
3 .2.3                שיטת הפרדה עבור Fmoc- Leu-OH.. מנהל עסקים
3 .2.4                בדיקת RL עבור Signal to noise (S/N) משפטים
3 .2.5                פרה ולידציה. 16
3.2.5.1      בדיקת אמינות קריאת הגלאי ברגישות גבוהה. 16
3.2.5.2      Robustness. 16
3 .3                 מכשור וציוד. 17
4 .                   תוצאות.. 18
4 .1                 עמודת Chiral Pak QN-AX.. 18
4 .1.1                סריקה ראשונית (Screening) בעמודה מסוג Chiral Pak QN-AX.. 18
4 .1.2                אופטימיזציית שיטה. 20
4 .1.3                בדיקת RL. 21
4.1.3.1      בדיקת RL לחישוב Signal to noise (S/N) עבור אננטיומר D.. 21
4 .1.4                פרה ולידציה. 22
4.1.4.1      בדיקת אמינות קריאת הגלאי ברגישות גבוהה עבור אננטיומר D.. 22
4.1.4.2      Robustness. 22
4 .1.5                בדיקת RL לחישוב Signal to noise (S/N) עבור אננטיומר L של חומצות                           האמינו הנבדקות.. 23
4 .1.6                בדיקת אמינות קריאת הגלאי ברגישות גבוהה עבור אננטיומר L. 23
4 .2                 עמודה Chirobiotic T..
5
4 .2.1                בדיקת ספקטרופוטומטר של חומצות האמינו הנבחרות..
5
4 .2.2                סריקה ראשונית.. 26
4 .2.3                אופטימיזציה של השיטה. 28
4.2.3.1      גרדיאנט. 28
4.2.3.2      pH.. 29
4.2.3.3      טמפרטורה. 30
4 .2.4                בדיקת RL. 30
4 .2.5                Robustness. 31
5.                   דיון 32
5.1                 שלב ה-Screening. 32
5.1.1                עמודה Chirobiotic T.. 32
5.1.2                עמודה Chiral Pak QN-AX.. 32
5.2                 פרמטרים נבדקים. 32
5.2.1                ריכוז דוגמא. 32
5.2.2                אורך גל. 32
5.2.3                ממס וגרדיאנט. 33
5.2.4                pH.. 33
5.2.5                ספיקה. 33
5.2.6                טמפרטורה. 33
5.3                 קביעת RL. 33
5.4                 השוואה בין העמודותQN – AX  ChiralPak ו- Chirobiotic T.. 34
5.5                 השוואה בין תנאי מערכת סופיים שנקבעו בעמודותQN – AX  ChiralPak ו- Chirobiotic T.. 35
6 .                   מסקנות.. 37
7.                   ביבליוגרפיה. 38
8 .                   נספחים. 40 טבלאות טבלה מס' 1- קבוצות הגנה צדדיות של חומצות אמיניות -2
טבלה מס' 2- רשימת חומצות אמינו .12
טבלה מס' 3- רשימת בופרים –12
טבלה מס' 4- רשימת מלחים –.13
טבלה מס' 5- רשימת ממסים –.13
טבלה מס' 6- שיטות הסריקה הראשונית השונות בעמודה T ………………………….chirobiotic מנהל עסקים טבלה מס' 7- תיאור השיטות בהן נעשה שימוש במהלך הסריקה הראשונית של חומצות האמינו המוגנות —
משפטים טבלה מס' 8- בדיקת אמינות קריאת הגלאי ברגישות גבוהה (ליניאריות):
סיכום אחוזים וריכוזים 16
טבלה מס' 9- רשימת ציוד מעבדתי ..17
טבלה מס' 10- סריקה ראשונית של ששת חומצות האמינו המוגנות ב- HPLC בעמודה Chiral Pak QN-AX –18
טבלה מס' 11- אופטימיזציית גובה הפיק לפי ריכוז — 20 טבלה מס' 12- מציאת S/N לשם חישוב RL עבור אננטיומר D -…
21
טבלה מס' 13- בדיקת ליניאריות עבור אננטיומר D של חומצה אמינית Fmoc-Leu-OH .. 22
טבלה מס' מנהל עסקים- מציאת S/N לשם חישוב RL עבור אננטיומר ……………………………….……..L
2 3
טבלה מס' משפטים- בדיקת אמינות קריאת הגלאי ברגישות גבוהה עבור אננטיומר L של חומצה אמינית …………………………………………………………………………………….Fmoc-Leu-OH
2 4
טבלה מס' 16- שינויים בגרדיאנט -28
טבלה מס' 17- שינויים ב- pH –29
טבלה מס' 18- שינויים בטמפרטורה 30 טבלה מס' 19- רגישות בדיקת RL ל-S/N -..30 טבלה מס' 20- השוואה בין חומצות האמינו המוגנות Fmoc-Tyr (tBu)-OH ו- Fmoc-Leu-OH בעמודות ChiralPak ו-…………………………………………………………………Chirobiotic T 34
איורים איור מס' 1- קשירת חומצה אמינית ראשונה ברצף לפולימר 1
איור מס' 2- מבנה מולקולת ה- teicoplanin -..6
איור מס' 3- מבנה מולקולת ה- O-9-tert-butylcarbamate of Quinine 7
איור מס' 4- מבנה מולקולת ה- teicoplanin aglycone -…7
איור מס' 5- מבנה מולקולת ה-vancomycine -8
איור מס' 6- ספקטרופוטומטר של Fmoc-tyr(tBu)-OH באורך גל 265nm –
5 איור מס' 7- ספקטרופוטומטר של Fmoc-Leu-OH באורך גל 265nm –..
5 איור מס' 8- הרצה איזוקרטית ב-HPLC לחומצה האמינית Fmoc-tyr(tBu)-OH –..26
איור מס' 9- הרצה איזוקרטית ב-HPLC לחומצה האמינית Fmoc-Leu-OH -27
איור מס' 10- HPLC של ח.א Fmoc-tyr(tBu)-OH -…35
איור מס' 11- HPLC של ח.א Fmoc-Leu-OH –…
35
איור מס' 12- HPLC של ח.א Fmoc-tyr(tBu)-OH -..
35
איור מס' 13- HPLC של ח.א Fmoc-Leu-OH –…
35
גרפים גרף מס' 1- השטח של Fmoc-Leu-OH כפונקציה של הריכוז באחוזים (%) -22  גרף מס' 2- השטח של Fmoc-Leu-OH כפונקציה של הריכוז באחוזים (%) -24
כרומוטוגרמות כרומטוגרמה מס' 1- 100% אננטיומר D של ח.א Leucine- Fmoc-D-Leu-OH 19
כרומטוגרמה מס' 2- 100% אננטיומר L של ח.א Leucine- Fmoc-L-Leu-OH 19
כרומטוגרמה מס' 3- תערובת רצמית של 50% אננטיומר L ו-50% אננטיומר D 20 נספחים נספח מס' 1- כרומטוגרמות של חומצות האמינו שנבדקו ..40 נספח מס' 2- ריכוז תוצאות בדיקת אמינות קריאת הגלאי ברגישות גבוהה (ליניאריות) עבור אננטיומר D -48
נספח מס' 3- ריכוז תוצאות Robustness עבור שינויים שבוצעו במערכת –55
מבוא חלק נרחב מהתרופות הקיימות היום בשוק מסתמכות על רכיב פעיל בעל כיראליות מוגדרת. רכיבים פעילים אלו לרוב מורכבים מפפטידים של חומצות אמינו כיראליות. לכן, בעת הייצור יתקבלו לרוב רכיבים נוספים, אננטיומרים או דיאסטריומרים, בעלי תכונות שונות מהרכיב הפעיל המבוקש. רכיבים נוספים אלו עלולים במקרה הגרוע להוות סכנה בריאותית לנוטלי התרופה.
בנוסף, מרבית התרופות, כ-75% מהן, אינן טהורות ומכילות לפחות אננטיומר אחד נוסף לחומר הפעיל. בתעשיית התרופות קיימות דרישות רגולטוריות ברורות אשר מטרתן להבטיח כי התרופות מיוצרות בתנאי ייצור נאותים ומבוקרים תוך בקרה מתמדת לעמידה  בתקנים המבוקשים. שתיים מהבדיקות העיקריות הן  בדיקת כמות החומר הפעיל והיעדר אננטיומרים מזיקים. על כן, יש צורך לפתח כלים שיאפשרו לנו לזהות בזמן אמת את הרכיבים השונים, כולל פירוט אודות הכיראליות